Offre de thèse à l'ICOA Orléans

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Edité le 08/03/2017

L'ICOA propose une offre de thèse sur le thème: Etude du métabolisme des nucléosides au niveau cellulaire par suivi enzymatique en EC-HRMS / CE-HRMS platform for nucleoside metabolism study in cell through enzyme kinetics

Durée et date de début: 3 ans, début de préférence : le 1 octobre 2017

Laboratoire d'accueil: Institut de Chimie Organique et Analytique (ICOA) - UMR 7311. Université d'Orléans

Equipe : Stratégies analytiques, Affinités et Bioactifs (SAAB)

Personnes à contacter: Reine Nehmé et Philippe Morin

Résumé :

Le métabolome d'une cellule définit en partie son phénotype métabolique et son analyse permet de comprendre un grand nombre de phénomènes, en particulier la variabilité des processus biologiques ainsi que l'hétérogénéité fonctionnelle des cellules (Altschuler et al., cell 2010. Spiller et al., Nature 2010). D'un point de vue analytique, les cellules sont des échantillons de très faible volume qui contiennent une grande variété de métabolites aux propriétés physico-chimiques diverses et aux concentrations différant de plusieurs ordres de grandeur. Les techniques séparatives couplées à des instruments d'analyse récents, tels que la spectrométrie de masse à haute résolution (HRMS), offrent des possibilités puissantes d'analyse de ces métabolites. Parmi celles-ci, l'électrophorèse capillaire (CE) couplée à la spectrométrie HRMS permet de réaliser des analyses rapides qui ne nécessitent que de faibles volumes d'échantillons injectés (quelques nLs) pour identifier et quantifier les métabolites contenus dans une cellule (Lapainis et al., Anal. Chem. 2009). 
Dans cette thèse, nous envisageons de développer une plateforme EC-HRMS qui permette l'étude du métabolisme cellulaire et le suivi des cinétiques enzymatiques. Comme preuve de concept, le métabolisme d'analogues nucléosidiques dans un fibroblaste sera étudié en EC par la détermination des constantes cinétiques (Km, Vmax, IC50) de plusieurs kinases virales et cellulaires impliquées dans leur activation ainsi que de polymérases. Notre recherche sera menée en utilisant comme modèle deux agents antiviraux, l'aciclovir et le cidofovir, utilisés pour la prise en charge des infections par le virus de l'herpès simplex (HSV). Les dosages seront développés en utilisant des enzymes purifiées, des lysats de cellules de fibroblastes puis des cellules entières. La quantification des produits enzymatiques et/ou des substrats par le CE-HRMS permettra de suivre le métabolisme de ces analogues de nucléosides. Des collaborations nationales et internationales seront impliquées pour garantir le succès du projet.

Abstract
Investigating the composition of the cellular metabolome is important for understanding a variety of phenomena, including single-cell biological variability and functional heterogeneity (Altschuler et al., cell 2010. Spiller et al., Nature 2010). Cells represent volume-limited samples containing a wide variety of metabolites with different physico-chemical properties and concentrations that span orders of magnitude. Chemical separations hyphenated to recent instrumentation such as high resolution mass spectrometry (HRMS) offer powerful options for metabolite analysis. Among the separation methods, capillary electrophoresis (CE), with its nano-sample volume requirements and fast analysis time, enables microanalyses that include profiling and quantitation of metabolites in single cells (Lapainis et al., Anal. Chem. 2009).
In this thesis, we intend to develop a CE-HRMS platform that enables studying metabolism in cells through monitoring of corresponding enzyme kinetics. As a proof-of-concept, the metabolism of nucleoside analogs (NA) in single fibroblast will be studied through CE monitoring of the kinetics (Km, Vmax , IC50) of cellular and viral kinases and polymerases involved in their activation. Our research will be conducted using as model two NA antiviral agents, aciclovir and cidofovir, employed for the management of Herpes Simplex Virus (HSV) infections. Assays will be developed using purified enzymes, fibroblast cell lysates and then entire cells. Quantifying enzymatic products and/or substrates by CE-HRMS will allow monitoring NA metabolism. National and international collaborations will be implicated in order to ensure the success of the project.

Références
1. P. Morin et al., Hyaluronidase reaction kinetics evaluated by capillary electrophoresis with UV and high-resolution mass spectrometry (HRMS) detection. Anal. Chim. Acta, 2017, 951, 140–150.
2. P. Morin et al., Human neutrophil elastase inhibition studied by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection and microscale thermophoresis. J. Chromatogr. A 2016, 1431, 215-223.
3. H. Bénédetti et al., New in-capillary electrophoretic kinase assays to evaluate inhibitors of the PI3k/Akt/mTOR signaling pathway. Anal. Bioanal. Chem. 2014, 406, 3743-3754.
4. P. Morin et al., Electrophoretically mediated microanalysis for in-capillary electrical cell lysis and fast enzyme quantification by capillary electrophoresis. Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 9159-9167.

 

Profil du candidat: 

Qualifications souhaitées:  Ingénieur Chimiste, Master 2 Chimie Analytique

Connaissances linguistique : Anglais

Autres qualifications :  Solides compétences en Sciences Séparatives et Spectrométrie de masse. Connaissances en Biochimie.
 

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